實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題分析與解決方案
上海金鵬分析儀器有限公司針對(duì)WB做不好的常見(jiàn)問(wèn)題分析與解決方案：
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問(wèn)題
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可能原因
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驗(yàn)證或解決辦法
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背景較高
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封閉不充分
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延長(zhǎng)封閉時(shí)間，更換合適的封閉劑(脫脂奶粉，BSA,血清等)
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一抗?jié)舛冗^(guò)高
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增加一抗稀釋倍數(shù)，
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抗體孵育溫度過(guò)偏高
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建議4℃孵育
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二抗非特異性結(jié)合
或與封閉劑交叉反應(yīng)
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設(shè)置二抗對(duì)照(不加一抗),降低二抗?jié)舛?
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一抗或二抗與封閉劑有交叉反應(yīng)
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在孵育和洗滌液中加入Tween-20以減少交叉反應(yīng).
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洗膜不充分
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增加洗滌次數(shù)
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膜不合適
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NC膜比PVDF膜背景低
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膜干燥
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保證充分的反應(yīng)液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象
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沒(méi)有陽(yáng)性條帶 或很弱
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一抗、二抗等不匹配
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訂購(gòu)試劑時(shí)認(rèn)真選取一抗與組織種屬， 一抗與二抗或/和底物與酶 系統(tǒng)之間相匹配的抗體及底物。可通過(guò)設(shè)置內(nèi)參可以驗(yàn)證二級(jí)檢測(cè) 系統(tǒng)的有效性。
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-抗或/和二抗?jié)舛鹊?
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增加抗體濃度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間
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封閉劑與一抗或二抗有交叉反應(yīng)
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封閉時(shí)使用溫和的去污劑，如TWEEN20,或更換封閉劑(常用的 脫脂奶、BSA、血清或明膠
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一抗不識(shí)別目的物種的靶蛋白
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檢查說(shuō)明書(shū)，或做ClustalW比對(duì)，設(shè)陽(yáng)性對(duì)照
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樣本中無(wú)靶蛋白或靶蛋白含量過(guò) 低(抗原無(wú)效)
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設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，如果陽(yáng)性對(duì)照有結(jié)果，但標(biāo)本沒(méi)有則可能是標(biāo)本中 不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加標(biāo)本上樣量至少每孔 20-30ug蛋白，樣本制備時(shí)使用蛋白酶抑制劑，或分級(jí)提取目的蛋白。
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轉(zhuǎn)膜不充分，或洗膜過(guò)度
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使用麗春紅S檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效果，PVDF膜需浸透，需正確的轉(zhuǎn)膜操作，勿 過(guò)度洗膜
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過(guò)度封閉
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使用含0.5%脫脂奶或無(wú)脫脂奶的抗體稀釋液，或更換封閉劑，減少 封閉時(shí)間
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一抗失效
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使用有效期內(nèi)抗體，分裝保存，避免反復(fù)凍融取用，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用
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二抗受疊氮鈉抑制
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所用溶液和容器中避免含有疊氮鈉(HRP的抑制劑)
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酶和底物失效
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直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說(shuō)明酶失活了、選擇在有 效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物，使用新鮮的底物.
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曝光時(shí)間過(guò)短
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延長(zhǎng)曝光時(shí)間
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多非特異性條 帶
或條帶位置不 對(duì)
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細(xì)胞傳代次數(shù)過(guò)多，使其蛋白表 達(dá)模式的分化
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使用原始或傳代少的細(xì)胞株，或平行實(shí)驗(yàn)
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體內(nèi)表達(dá)的蛋白樣本具有多種修 飾形式：乙酰化、磷酸化、甲基 化、烷基化、糖基化等
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查文獻(xiàn)，使用去修飾的試劑使蛋白恢復(fù)其正確的大小
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蛋白樣本降解
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使用新鮮制備的標(biāo)本，并使用蛋白酶抑制劑
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新蛋白或同族蛋白的分享同種表 位的不同剪接方式
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查其它文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，或BLAST搜尋，使用說(shuō)明書(shū)報(bào)導(dǎo)的細(xì)胞株或組織
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一抗?jié)舛冗^(guò)高
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降低抗體濃度，可以減少非特異性條帶
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二抗?jié)舛冗^(guò)高產(chǎn)生非特異性結(jié)合
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降低抗體濃度，增加二抗對(duì)照
選擇特異性更強(qiáng)，只針對(duì)重鏈的二抗
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抗體未純化
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使用單克隆或親和純化的抗體，減少非特異條帶
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蛋白存在二聚體或多聚體
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SDS-PAGE電泳上樣前，煮沸10 min,
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以增強(qiáng)蛋白質(zhì)解聚變性
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背景有白色/黑 色斑點(diǎn)
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轉(zhuǎn)膜時(shí)有氣泡或抗體分布不均
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盡量去除氣泡，抗體孵育時(shí)保持搖動(dòng)
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抗體與封閉劑結(jié)合
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過(guò)濾封閉劑
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暗片現(xiàn)白條帶
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一抗或二抗加入過(guò)多
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稀釋抗體的濃度
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目的條帶過(guò)低/ 過(guò)高
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SDS-PAGE膠濃度選擇不合適
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調(diào)整膠濃度，分子量大的蛋白用低濃度膠，分子量小的蛋白用高濃 度膠
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“微笑”條帶
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遷移過(guò)快，電泳溫度過(guò)高
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降低電泳速度，低溫電泳(冷室)
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轉(zhuǎn)膜不充分
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膜沒(méi)有完全均勻濕透
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使用100%methanol漫透膜
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靶蛋白分子量小于10,000
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選擇小孔徑的膜，縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間
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靶蛋白等電點(diǎn)等于或接近轉(zhuǎn)移緩 沖液pH值
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|可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液(pH10.5)或使用低pH值緩 沖液如乙酸緩沖液
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甲醇濃度過(guò)高
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過(guò)高甲醇濃度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同
時(shí)會(huì)使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。降低甲醇 濃度或者使用乙醇或異丙醇代替
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轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠Thick gel
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對(duì)于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間
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